為了對以個(gè)特定序列進(jìn)行PCR做重復檢測，需要三個(gè)不同的區域，每一個(gè)區域的具體技術(shù)操作和試劑在下面詳細列出。

　　1、樣品準備區

　　這個(gè)區域專(zhuān)門(mén)用作樣品的準備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時(shí)應該采取預防措施：

　　1)PCR產(chǎn)物和帶有要擴增序列的DNA克隆不能在這個(gè)房間操作。

　　2)組織培養物、組織標本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準備間處理，以根據應用的需要提取DNA或RNA。

　　3)用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。

　　4)DNA樣品應該用有專(zhuān)門(mén)的防護或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時(shí)有氣溶膠遺留。

　　5)大體積樣品應該用單獨包裝的無(wú)菌一次性移液管吸取。

　　6)管子打開(kāi)前都要簡(jiǎn)短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開(kāi)，這樣會(huì )產(chǎn)生氣溶膠。

　　7)任何時(shí)候都應該穿實(shí)驗服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過(guò)程中每一步之間都要更換。實(shí)驗服要專(zhuān)門(mén)用于樣品準備間，經(jīng)常清洗。

　　2、樣品準備和RNA-PCR

　　RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機會(huì )。為了避免這一問(wèn)題，反轉錄一步可以在樣品準備區進(jìn)行。在RNA-PCR中應用UNG以防止污染的方法也有報道。

　　3、前PCR區

　　必須有專(zhuān)門(mén)用于準備各種反應的區域，這個(gè)區域必須保持干凈，而且沒(méi)有來(lái)自克隆和樣品準備的污染。前PCR區必須要有試劑和準備，特別是專(zhuān)門(mén)用于前PCR區的正壓活塞式移液管。

　　4、PCR實(shí)驗室試劑的操作

　　1)所用的所有溶液都應該沒(méi)有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。

　　2)所有PCR試劑中使用的水都應該是高質(zhì)量的-新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過(guò)濾的，并且是高壓滅菌。

　　3)在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類(lèi)的抗微生物劑，在擴增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴增反應。

　　4)所用試劑都應該以大體積配制，實(shí)驗一下看試劑是否滿(mǎn)意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。

　　5)所有試劑和樣品準備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。

　　6)新配制的試劑在用于準備新的標本之前應該加以檢驗。

　　7)樣品準備和前PCR區所使用的移液管在不使用時(shí)都應該小心保存。

　　5、在前PCR區建立PCR混合物

　　1)可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實(shí)驗室只涉及到擴增一種或少數幾種特異序列時(shí)這樣做很有用。

　　2)如果你的實(shí)驗室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應混合物不夠經(jīng)濟，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。

　　3)作為一個(gè)規則，應該保存一套陰性、弱陽(yáng)性和強陽(yáng)性對照樣品來(lái)分析樣品配制和PCR前過(guò)程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過(guò)使用一個(gè)已知的弱陽(yáng)性樣品來(lái)驗證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴增抑制物。

　　4)陰性樣品要與每組樣品同時(shí)做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對照應該包括核酸以外的所有試劑。

　　5)當做陽(yáng)性對照時(shí)，有兩個(gè)理由決定了應該使用最少數量的核酸。

　　6)由于必須有對照反應，對照模板的特點(diǎn)應該予以考慮。

　　6、控制污染的方法

　　已設計出很有力的酶學(xué)方法用來(lái)消除一種形式的污染—使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線(xiàn)，這種方法不能完全消除污染問(wèn)題，但可以將污染降低幾個(gè)數量級。

　　7、PCR儀的位置

　　8、后PCR區

　　PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數據，應該留出一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專(zhuān)門(mén)用于這一目的，決不能把實(shí)驗室這一區域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)。